Real-time ПЦР


Компания Алкор Био предлагает услуги по разработке и производству тест-систем для молекулярно-генетических исследований методами полимеразной-цепной реакции в режиме "реального времени".

Вы можете заказать тест для решения любой интересующей задачи, будь то выявление микроорганизма, определение SNP или количественный анализ.

Разработка тест-систем будет проводиться на основе современного метода – полимеразной-цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (Real-Time PCR). Основными преимуществами Real-Time PCR является:

  • объединение этапов амплификации и детекции, что, помимо упрощения процедуры анализа, снижает риск перекрестной контаминации;
  • возможность проведения количественного анализа;
  • высокая специфичность и чувствительность. 

Для определения SNP предлагаются две альтернативных схемы:

  •  На основе классического TaqMan

ПЦР-смесь содержит два аллель-специфичных зонда с различными флуорофорами. В процессе амплификации зонды конкурируют за связывание с матрицей в участке с SNP, при этом преимущество получает зонд, соответствующий представленному в образце аллелю. Если присутствует оба аллеля, то оба зонда будут гибридизоваться с одинаковой вероятностью. После гибридизации зонды расщепляются за счет экзонуклеазной активности Taq полимеразы, и детектируется нарастание флуоресценции:

Taqman1.jpg

Варианты флуоресцентных кривых:

taqman2.jpg

  • На основе анализа плавления дуплексов

ПЦР смесь содержит зонд с гасителем на 3’-конце, гибридизующийся на участок с SNP, прямой праймер без модификаций и обратный праймер с флуорофором на 5’конце. На первом этапе проводится ассиметричная ПЦР, в результате которой преимущественно образуется меченый флуорофором одноцепочечный продукт, имеющий в своем составе участок для гибридизации зонда:

snp1.jpg 

На втором этапе проводится плавление дуплексов: начиная с 25°C, температура реакционной смеси повышается до 95°C шагами по 0,5°C, на каждом шаге считывается флуоресценция. При 25°C все одноцепочечные продукты амплификации находятся в гибридизованном состоянии с зондом (флуорофор и гаситель сближены в составе дуплексов). В результате повышения температуры дуплексы начинают разрушаться, при этом флуорофор и гаситель также разобщаются, что приводит к повышению флуоресценции, которую фиксирует амплификатор с детектирующей системой в режиме реального времени:

snp2.jpg

В результате обработки кривых плавления с помощью программного обеспечения амплификатора определяются температуры плавления дуплексов. Дискриминация аллелей осуществляется за счет разницы в температурах плавления полностью комплементарных дуплексов и дуплексов с мисматчем:

snp3.jpg

За счет дискриминации аллелей по температурам плавления дуплексов, обеспечивается высокая специфичность анализа, так наличие соответствующего пика на графике с обработанными кривыми плавления однозначно свидетельствует о наличии искомого аллеля.

Дополнительное преимущество этого метода -  возможность выявлять редкие или неописанные полиморфизмы, так как любые отклонения в изучаемом участке отражаются на температуре плавления дуплекса.

Кроме того, обе системы позволяют производить определение нескольких полиморфизмов в одной пробирке, однако, дуплексный анализ в 2 раза более производительный.  Для анализа  1 полиморфизма в дуплексном анализе требуется 1  канал детекции амплификатора, а в классическом методе TaqMan- 2 канала:

DvT.jpg


За интересующей информацией Вы можете обратиться к нашим сотрудникам